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榫卯之約：五年“冷板凳”打磨自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)基因編輯工具
作者：李晨  來(lái)源：中國(guó)科學(xué)報(bào)
山東拓普生物工程有限公司  http://521google.com.cn
科研最開(kāi)心的時(shí)刻，不是論文發(fā)表，而是從近三年毫無(wú)進(jìn)展的黑暗中，第一次看到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示編輯效率達(dá)到百分之幾十的那一天。
“我們花了五年時(shí)間，有很多節(jié)點(diǎn)都覺(jué)得做不下去了，我頭發(fā)都掉了好多。”剛剛?cè)肼氈袊?guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所的研究員張華偉自嘲道。他帶領(lǐng)團(tuán)隊(duì)自主開(kāi)發(fā)的“榫卯連接系統(tǒng)”（Mortise-Tenon joint system，簡(jiǎn)稱MT），為水稻精準(zhǔn)基因組編輯提供了突破性解決方案。
這項(xiàng)研究于1月5日以封面文章形式在《分子植物》（Molecular Plant）上正式發(fā)表，由張華偉團(tuán)隊(duì)和中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所、崖州灣國(guó)家實(shí)驗(yàn)室李家洋院士團(tuán)隊(duì)合作完成。該技術(shù)DNA插入與替換效率最高達(dá)59.47%，作為先導(dǎo)編輯器的高效替代技術(shù)，成功繞開(kāi)了傳統(tǒng)精準(zhǔn)基因編輯工具的專利，為攻克基因編輯育種瓶頸問(wèn)題提供了關(guān)鍵利器。
從“卡脖子”到另辟蹊徑
白花花的大米飯背后藏著一場(chǎng)關(guān)乎國(guó)家糧食安全的科技競(jìng)賽。如何讓作物更抗旱、更抗病、產(chǎn)量更高？科學(xué)家們一直試圖尋找更精準(zhǔn)的方式“修改”植物的基因密碼。
然而，長(zhǎng)期以來(lái)，我國(guó)的精準(zhǔn)基因編輯技術(shù)卻一直依賴國(guó)外工具先導(dǎo)編輯系統(tǒng)（prime editor，簡(jiǎn)稱PE），這也成為我國(guó)農(nóng)業(yè)生物育種自主創(chuàng)新路上的“卡脖子”難題。
“這項(xiàng)研究要追溯到2019年底至2020年初，那時(shí)先導(dǎo)編輯技術(shù)剛出現(xiàn)不久�！睆埲A偉回憶道。先導(dǎo)編輯的原理非常巧妙，能給精準(zhǔn)基因編輯提供了一套非常好的框架方案，但是這套框架方案的專利期延續(xù)到2038年左右，這就筑起了一道長(zhǎng)期的技術(shù)壁壘。
中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)教授賴錦盛說(shuō)，先導(dǎo)編輯系統(tǒng)雖為植物精準(zhǔn)編輯的主流底層技術(shù)，但其核心專利壁壘卻成為我國(guó)作物育種商業(yè)化進(jìn)程中的關(guān)鍵“卡脖子”難題——不僅抬高了技術(shù)應(yīng)用成本，更嚴(yán)重制約精準(zhǔn)編輯技術(shù)在主糧、經(jīng)濟(jì)作物育種中的規(guī)�；�落地，使我��(guó)在作物性狀改良領(lǐng)域的創(chuàng)新潛力難以充分釋放。
中國(guó)科學(xué)院院士、崖州灣國(guó)家實(shí)驗(yàn)室副主任錢(qián)前指出，在基因編輯工具自主化進(jìn)程中，我國(guó)已取得顯著突破：以Cas12系列核酸酶為代表的序列特異性工具酶，搭配自主研發(fā)的堿基編輯器，已在多種作物育種中實(shí)現(xiàn)應(yīng)用，部分工具更是實(shí)現(xiàn)了效率與精準(zhǔn)度的雙重優(yōu)化，部分技術(shù)已通過(guò)國(guó)際授權(quán)實(shí)現(xiàn)反向輸出。這些成果為我國(guó)育種技術(shù)從跟跑向并跑轉(zhuǎn)變奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
精準(zhǔn)基因編輯是突破育種瓶頸的關(guān)鍵——改良作物關(guān)鍵農(nóng)藝性狀的堿基替換及DNA片段的準(zhǔn)確插入、替換和刪除，都依賴于高效精準(zhǔn)的編輯工具。然而，當(dāng)前主流的精準(zhǔn)編輯技術(shù)多數(shù)基于先導(dǎo)編輯系統(tǒng)開(kāi)發(fā)，其專利壟斷成為制約我國(guó)育種產(chǎn)業(yè)發(fā)展的“卡脖子”難題，嚴(yán)重限制了自主創(chuàng)新成果的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
2019年12月，張華偉在北京大學(xué)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究院建立了自己的實(shí)驗(yàn)室。他給自己定下一個(gè)目標(biāo)：建立一套我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的精準(zhǔn)基因編輯框架體系，開(kāi)發(fā)屬于中國(guó)自己的精準(zhǔn)編輯工具。
“基因編輯工具就像光刻機(jī)一樣，如果被‘卡脖子’，什么也做不了�！闭劶把邪l(fā)初衷，張華偉打了個(gè)比方：“類似于我們需要一套自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的‘光刻機(jī)’，用于基因編輯產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)。”
黑暗中摸索，冷板凳上堅(jiān)守
“前兩三年完全沒(méi)有數(shù)據(jù)，是非常痛苦的，感覺(jué)怎么做都失敗�！睆埲A偉說(shuō)，這套看似簡(jiǎn)單的系統(tǒng)背后，是團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)達(dá)五年的艱難探索。
研究初期，團(tuán)隊(duì)遇到了難以想象的困難。最大的難關(guān)就是“卯眼”結(jié)構(gòu)中的5’粘性末端的長(zhǎng)度可能具有搖擺性，可能產(chǎn)生多種類型的5’粘性末端，切口處可能有多個(gè)胞嘧啶，這樣就對(duì)“榫頭”中與之匹配的5’單鏈粘性末端的設(shè)計(jì)提出挑戰(zhàn)。
困難不僅來(lái)自技術(shù)層面，還有方法論上的挑戰(zhàn)。團(tuán)隊(duì)最初使用植物細(xì)胞去除細(xì)胞壁后的原生質(zhì)體體系進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這是基因編輯工具開(kāi)發(fā)的常規(guī)方法。但他們發(fā)現(xiàn)，在他們的實(shí)驗(yàn)中這套體系效率極低。
“我們組里的成員一直做到幾乎崩潰，有一次課題討論會(huì)上，一作孫文靜當(dāng)時(shí)都快哭了。就感覺(jué)真的是在黑暗中摸索，一點(diǎn)希望都沒(méi)有�！睆埲A偉說(shuō)，在實(shí)驗(yàn)遇到困難，快沒(méi)有信心時(shí)，是李家洋老師給了他們鼓勵(lì)和幫助，幫他們度過(guò)了一個(gè)個(gè)難關(guān)。“李老師在百忙之中，多次面對(duì)面或者打電話，及時(shí)、親切地鼓勵(lì)和指導(dǎo)，給了我們很大的勇氣和毅力�！�
李家洋老師經(jīng)常和他們說(shuō)，科研要坐得住“冷板凳”。關(guān)鍵時(shí)刻，他還給出了轉(zhuǎn)折性的建議：由于水稻基因編輯工作要在愈傷組織中實(shí)現(xiàn)，何不直接在愈傷組織中嘗試這個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)兀?/span>
張華偉回憶道，由于不同植物組織中的修復(fù)機(jī)制不同，這一轉(zhuǎn)變的確給研究迎來(lái)了轉(zhuǎn)機(jī)。
后續(xù)研究中，他們進(jìn)一步整理數(shù)據(jù)，意外發(fā)現(xiàn)了規(guī)律。“我們從那一堆看似雜亂無(wú)章的完全沒(méi)有效率的數(shù)據(jù)里面發(fā)現(xiàn)，好像只要一遇到TC，基因編輯效率就能起來(lái)。”張華偉說(shuō)。
這一發(fā)現(xiàn)讓團(tuán)隊(duì)興奮不已：“趕快試了一下，試完以后立馬就開(kāi)心了！第一次做出來(lái)有百分之幾十的編輯效率。”張華偉說(shuō)那是研究過(guò)程中最開(kāi)心的時(shí)刻。最終他們選擇了特異且高效識(shí)別TC的胞嘧啶脫氨酶（APOBEC3B）解決了編輯效率低的問(wèn)題。
高效無(wú)痕的編輯技術(shù)
在送女兒去聽(tīng)音樂(lè)會(huì)的路上，張華偉心里還想著他的基因編輯框架。
突然靈光一閃，中國(guó)古建筑傳統(tǒng)木工中的榫卯結(jié)構(gòu)躍入他的腦海，和他們研發(fā)的框架系統(tǒng)非常相似——通過(guò)構(gòu)建相互匹配的“榫頭”與“卯眼”，實(shí)現(xiàn)DNA片段的精準(zhǔn)整合。
具體而言，他們?cè)谒�稻基因組目標(biāo)位點(diǎn)制造出特殊的雙鏈斷裂結(jié)構(gòu)（即“卯眼”），該結(jié)構(gòu)具有單端或雙端非互補(bǔ)的5’突出端。隨后合成雙鏈DNA供體作為“榫頭”，供體兩端帶有與“卯眼”完全互補(bǔ)的5’粘性末端。通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)及連接，“榫卯連接系統(tǒng)”可實(shí)現(xiàn)DNA片段的定向精準(zhǔn)插入和替換。
“榫卯連接系統(tǒng)”的性能令人振奮。在僅含單個(gè)TC基序的GRF1基因位點(diǎn)，“榫卯連接系統(tǒng)”的正向插入效率分別達(dá)到46.55%、48.12%，且無(wú)反向插入；而傳統(tǒng)Cas9系統(tǒng)搭配平端供體時(shí)效率僅1%。
在含3個(gè)TC基序的IPA1基因位點(diǎn)，當(dāng)供體為8nt粘性末端時(shí)，“榫卯連接系統(tǒng)”的正向插入效率達(dá)83.54%，精準(zhǔn)插入效率59.47%，是Cas9系統(tǒng)的7倍以上。
與傳統(tǒng)技術(shù)相比，“榫卯連接系統(tǒng)”還具有“無(wú)瘢痕編輯”的突出特點(diǎn)。張華偉解釋說(shuō)，之前有一些體系，能夠?qū)崿F(xiàn)DNA的高效插入，一般使用轉(zhuǎn)座酶，轉(zhuǎn)座酶介導(dǎo)的高效插入需要借助于一種稱為重組酶識(shí)別位點(diǎn)的序列，這個(gè)序列會(huì)在外源DNA插入后，保留在插入片段的兩端，有點(diǎn)像手術(shù)傷口愈合留下的疤痕�！岸�我們的榫卯連接系統(tǒng)不需要借助于這樣的序列，編輯之后，不會(huì)留下任何多余堿基�！�
錢(qián)前院士表示，這種模擬榫卯咬合的設(shè)計(jì)，既規(guī)避了PE系統(tǒng)的專利壁壘，又在編輯效率和準(zhǔn)確性上展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，為精準(zhǔn)基因編輯提供了全新技術(shù)路徑。該系統(tǒng)的建立將有助于在育種實(shí)踐中，賦能主糧、經(jīng)濟(jì)作物的性狀改良，加速高產(chǎn)、抗逆、優(yōu)質(zhì)新品種培育，助力破解“抗逆必減產(chǎn)”等行業(yè)困局。更重要的是，MT系統(tǒng)的自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)屬性，將推動(dòng)我國(guó)精準(zhǔn)編輯領(lǐng)域從“技術(shù)引進(jìn)”向“自主創(chuàng)新”轉(zhuǎn)型，增強(qiáng)在全球種業(yè)競(jìng)爭(zhēng)中的話語(yǔ)權(quán)，為保障國(guó)家種源安全提供核心技術(shù)支撐，彰顯了傳統(tǒng)智慧與現(xiàn)代科技融合的創(chuàng)新力量。
“一開(kāi)始，我們也沒(méi)有想到這個(gè)原創(chuàng)系統(tǒng)會(huì)這么高效率，畢竟傳統(tǒng)Cas9系統(tǒng)也是經(jīng)過(guò)很多年的不斷迭代才提高編輯效率的�！睆埲A偉強(qiáng)調(diào)，研發(fā)出一份具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的基因編輯框架系統(tǒng)才是他們團(tuán)隊(duì)最為看重的。
“我們只是部分解決了‘卡脖子’的問(wèn)題。在基因編輯領(lǐng)域中，我們解決了最難做的框架層次問(wèn)題，但中間的一些元件還是非國(guó)產(chǎn)的�！睆埲A偉說(shuō)，未來(lái)5年左右，希望聯(lián)合國(guó)內(nèi)多家實(shí)驗(yàn)室圍繞“榫卯連接系統(tǒng)”建立完全國(guó)內(nèi)知識(shí)產(chǎn)權(quán)的精準(zhǔn)基因編輯工具，服務(wù)于精準(zhǔn)分子育種。
他們將從兩個(gè)方面解決TC序列偏好性的問(wèn)題：一是尋找特異識(shí)別其他序列的高效脫氨酶或者糖基化酶，替代現(xiàn)有系統(tǒng)；二是實(shí)現(xiàn)大片段高效替換，這樣即使是存在TC序列偏好性，也沒(méi)有問(wèn)題。
目前的研究是在水稻中完成的，但張華偉表示，“榫卯連接系統(tǒng)”在小麥、玉米等主要農(nóng)作物中也有廣泛應(yīng)用潛力。
“做這件事的時(shí)候有50%以上是靠情懷在支撐，要不然真的做不下去�！闭�是這種堅(jiān)持，讓團(tuán)隊(duì)在基因編輯領(lǐng)域開(kāi)辟了一條全新的技術(shù)路徑。
相關(guān)論文信息：https://doi.org/10.1016/j.molp.2025.11.006
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